Оптимізація зручних ПЛР у режимі реального часу

Якщо це кількісна ПЛР флуоресценції в режимі реального часу для кількісного визначення вірусу та генотипування SNP, нам потрібна ПЛР-машина з найбільшою можливою специфічністю; Якщо це виявлення збудника та мРНК, нам потрібна машина ПЛР з високою чутливістю , то як ми повинні оптимізувати цю машину ПЛР?

Ось список вмісту:

l Поліпшення ефективності ампліфікації ПЛР машини

l Використання праймерів ПЛР у реальному часі для загальної ПЛР

Поліпшення ефективності ампліфікації ПЛР машини

Для покращення ефективності, специфічності та чутливості ПЛР-машини ми можемо оптимізувати кількісну ПЛР-машину флуоресценції в режимі реального часу для експерименту через ряд заходів. Перший - це вибір цільової послідовності.

1, вибір зручної послідовності ПЛР в режимі реального часу відповідна довжина від 50 до 150bp. Коротші послідовності потребують менше часу для синтезу та коротших термінів ампліфікації, тому можливість ампліфікованого забруднення ДНК зменшується.

2, вибираючи цільову послідовність, використовуйте пошук вибуху, щоб проаналізувати цільову послідовність для поліморфізмів та помилок послідовності та уникнути їх. Якщо в цільовій послідовності є повторювані послідовності, це зменшить чутливість до виявлення цієї ПЛР -машини, а також слід уникати.

3, Контроль вмісту GC ≤ 60% у цільовій послідовності. Високий вміст GC, вплине на денатурацію цільової послідовності в тепловому циклі, але також простий у виробництві цієї неспецифічної ампліфікації ПЛР.

4, уникайте генерування вторинної структури. Цільові послідовності із зворотними повторювальними послідовностями легко створити вторинну структуру, що впливає на гібридизацію зручних праймерів та зондів ПЛР в реальному часі.

На додаток до цього, ми також повинні переконатися, що якість шаблону не вплине на посилення, результати зручної машини ПЛР у реальному часі мають надійність. Наприклад, пошкоджена ДНК не може бути адекватно ампліфікована в машині ПЛР або взагалі не посилюється. Також наявність реагентів ДНК -полімерази, що інгібують (DMSO тощо) та забруднення (SDS тощо) у шаблоні можуть впливати на надійність результатів ампліфікації ПЛР.

Використання праймерів ПЛР у реальному часі для загальної ПЛР

Отримайте зручні праймери у режимі реального часу ПЛР , цей метод також може бути використаний для звичайної ПЛР.

1, довжина повинна бути 18-30bp, щоб забезпечити специфічність зв'язування.

2, температура плавлення (значення ТМ) повинна бути 55-60 ° C, а значення TM двох праймерів повинні відрізнятися на 2-3 ° C.

3, кожен праймер повинен мати від 1 до 3 гуанінів або цитозинів на 3 'кінці, що може зручно зменшити неспецифічне посилення під час ПЛР-машини в режимі реального часу. Більше 3 буде відступати і спричинить 'ковзаючий ефект ', що призведе до неправильного розширення.

4. Вміст GC у праймерах повинен становити близько 50%, занадто високий вміст GC збільшить значення TM.

5, праймери ПЛР -машини повинні уникати зворотних повторюваних послідовностей, оскільки він утворює вторинну структуру, що впливає на зв'язування праймерів на шаблон.

6, якщо це RT-PCR, вам також потрібно уникати проектування праймерів, щоб зв'язатись із послідовностями екзонів, що призведе до помилково-позитивних експериментальних результатів ПЛР-машини. Правильний підхід повинен бути розроблений на довгій інтронній фланзі, або коротких інтронах, або через область екзона-екзон.

7. Здійснення та очищення праймерів.

Зауважте, що іноді, коли ви робили всі моменти, праймери можуть не посилити, тому ви повинні переробити праймери.

Орієнтуючись на швидке виявлення нуклеїнової кислоти та швидкому виявленні POCT, Bioteke пропонує види лабораторних інструментів, як: збір відбору вірусів, автоматичний екстрактор нуклеїнової кислоти, машину ПЛР та дезінфікуючі апарати. І він також забезпечує багато видів реагентів та наборів.